產(chǎn)品及特點: 1. 即開即用,用戶只需要提供病毒樣品。 2. 根據(jù)保守序列設(shè)計的專一性引物,與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。 3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應(yīng)。 4. 一管式熒光定量PCR檢測,避免后續(xù)污染。 5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。 本產(chǎn)品只適用于科研,不能用于臨床診斷。 參數(shù)規(guī)格: 產(chǎn)品名稱:甲型H1N1流感病毒(2009)PCR檢測試劑盒 產(chǎn)品規(guī)格:50T 產(chǎn)品貨號:FS-P63211 產(chǎn)品規(guī)格:50T 產(chǎn)品運輸:低溫運輸 產(chǎn)品保存:-20℃保存 產(chǎn)品有效期:一年 產(chǎn)品特點:本產(chǎn)品就是根據(jù)保守區(qū)設(shè)計引物而開發(fā)的高靈敏熒光定量 PCR 產(chǎn)品。 運輸及保存 低溫運輸,-20℃保存,保存期限一年。 自備試劑 DNA模板、10×ROX(根據(jù)機型決定,具體見使用方法)。 實驗注意事項: 1)RT-PCR可以檢測組織、細胞、血液、等很多材料,不同的樣本有不同要求,實驗前請充分溝通確認實驗方案和樣本情況; 2)客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種、基因準確的名稱和ID號; 3)客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。 4)樣本保存于液氮或干冰,也可以保存于Trizol液中。 實時熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類,探針類是利用與靶細胞序列特異性雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加,非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計的引物來指示擴增的增加。運用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進行定量(包括定量和相對定量)和定性分析。 主要服務(wù):DNA或RNA的定量分析、基因表達差異分析、基因分型。 主要技術(shù):引物設(shè)計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。 實驗過程: 一、試劑準備 1. DNA模板 2.對應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物??梢允荄NA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此,擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物) 3.10×PCR Buffer 4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5.Taq酶 二、操作步驟 1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。 10×PCR buffer 5μl dNTP mixl 4μl 引物1(10pM) 2μl 引物2(10PM) 2μl Taq酶(2U/μl) 1μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。 2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。 3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。 4.PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。 使用方法: 一、稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例) 1. 注意:由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。 2. 標記6個離心管,分別為7,6,5,4,3,2。 3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。 4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。 5. 換槍頭,在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。 6. 換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中,充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。 7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。 二、樣品DNA的制備 8. 如果有N個樣品,必須設(shè)置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對照的第4號(濃度為1×10E4 拷貝/μL,10μL相當于1萬拷貝)或第5號(濃度為1×10E5 拷貝/μL,10μL相當于10萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,則PC和NC的體積也必須是200μL。 9. 用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。 三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20 μL體系,在樣品制備室進行) 10. 如果只做1次重復(fù),則標記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照,6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù),則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。 11. 產(chǎn)品僅用于科研在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加) 醛縮酶2抗體 胰腺α淀粉酶抗體 錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白11抗體 磷酸化非受體酪氨酸激酶c-Abl抗體 磷酸化活化復(fù)制因子2抗體 醛固酮還原酶家族1成員D1抗體 肝血管**素相關(guān)蛋白抗體 自水解酶結(jié)構(gòu)域5蛋白抗體 ?;o酶A硫酯酶8 溶血磷脂酸?;D(zhuǎn)移酶β抗體 AFP4b蛋白抗體 載脂蛋白C2抗體 載脂蛋白A5抗體 載脂蛋白A2抗體 溶血磷脂酸?;D(zhuǎn)移酶D抗體 載脂蛋白E3抗體 ABI基因家族2抗體 氧化蛋白質(zhì)水解酶 鐵調(diào)節(jié)蛋白2抗體 乙醛脫氫酶1型抗體 AFP4a蛋白抗體 Rho GTP酶激活蛋白32抗體 能量平衡相關(guān)蛋白抗體 禽腦脊髓炎病毒AEV抗體